|
|
The role of anillin in the growth cone of neurons
Tomášová, Štěpánka ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
Axony nově vznikajících neuronů se musí během embryonálního vývoje správně propojit, aby vytvořily fungující neurální síť. Pro tento účel slouží růstový kónus, vysoce dynamická struktura na konci rostoucích axonů, která zajišťuje navigaci i samotný pohyb. Pro správné hledání cesty je nutná komunikace mezi aktinem a mikrotubuly. Přesný mechanismus takové kooperace však dosud není objasněn. Tato diplomová práce studuje možnou roli proteinu anillinu v tomto procesu. Anillin byl studován ve dvou lidských buněčných liních. V SH-SY5Y neuroblastomové linii byla provedena transgenní overexprese a siRNA knock-down. Zvýšení exprese anillinu v SH-SY5Y buňkách vedlo k vzniku poškozených neuritů, zatímco buňky se sníženou expresí tvořily méně neuritů. Dále byly studovány neurony diferencované z lidských iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), ve kterých se exprimuje endogenní fluorescenčně značený anillin. Zde byly pozorovány lokální dynamické shluky anillinu na bázi dynamických výběžků diferencujících se neuronů. Shluky se objevovaly zejména během migrace, iniciace nových neuritů, ale také v čerstvě vzniklých růstových kónech. Tyto výsledky nasvědčují tomu, že anillin hraje roli v zakládání neuritů lidských neuronů. Pro odhalení přesné funkce anillinu v těchto buňkách bude třeba další práce.
|
|
|
Role of NAV3 in glioblastoma cells invasiveness
Legátová, Anna ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Invazivita nádorových buněk a tvorba metastáz je hlavním důvodem, proč mají nádorová onemocnění velmi závažný dopad. Proto je vývoj léků (tzv. migrastatik), které cílí právě na tyto procesy a tím omezují šíření buněk z primárního nádoru, pro zmírnění závažných komplikací velmi důležitý. Pro vývoj migrastatik je však nezbytně nutné pochopit molekulární mechanismy, které buněčnou migraci ovlivňují. Cytoskeletální struktury zastávají nenahraditelnou roli v buněčné migraci, a mohou tak sloužit jako jedny z potenciálních cílů migrastatické léčby. Tato práce se věnuje Neuron navigátoru 3 (NAV3), proteinu, který se váže na + konce mikrotubulů (MT), podílí se na jejich stabilizaci a dokáže zprostředkovat komunikaci mezi nimi a aktinovou sítí. Tato funkce je důležitá pro směřování MT do prodlužujících se axonů, čímž se zajišťuje jejich správný růst, který je fyziologicky nezbytný pro vývoj mozku. Výsledky této práce naznačují, že NAV3 může působit jako pronádorový faktor, který lokalizuje nejen na + konce MT i do buněčných výběžků a jeho přítomnost pomáhá glioblastomovým buňkám se rozpínat a zvyšovat jejich invazivní potenciál. Klíčová slova: neuronový navigátor 3, mikrotubuly, nádory, invazivita, cytoskelet
|
|
|
Tubulin post-translational modifications and microtubule associated proteins in neural development and disease.
Belyaeva, Polina ; Balaštík, Martin (vedoucí práce) ; Siahaan, Valerie (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou základními složkami cytoskeletu všech eukaryotických buněk. Jejich funkce je zvláště důležitá v neuronech, kde MT stabilizují jejich dlouhé procesy a jsou zodpovědné za přesně regulovaný anterográdní a retrográdní, intra-axonální a intra-dendritický transport na dlouhé vzdálenosti. MT jsou nezbytné také během vývoje mozku obratlovců a všech jeho hlavních kroků: neurogeneze, migrace neuronů a diferenciace neuronů. MT jsou regulovány na mnoha úrovních, ale dvě se zdají být obzvláště důležité: 1. bylo prokázáno, že posttranslační modifikace tubulinu (PTM) řídí vlastnosti MT, jako je stabilita nebo transport na bázi MT. 2. proteiny asociované s mikrotubuly (MAP), které vážou rozpustné podjednotky MT, mřížku MT i konce MT a řídí transport na bázi MT a dynamiku MT buď stabilizací, destabilizací nebo přetrháváním MT. Deregulace tubulinových PTM nebo MAP může proto vyvolat závažné změny v neuronálním cytoskeletu. Bakalářská práce shrnuje současné znalostí o tom, jak PTM (zejména polyglutamylace) a MAP (zejména proteiny štěpící mikrotubuly jako spastin) regulují MT a vývoji a degeneraci neuronů. Klíčová slova: Mikrotubuly, tubulin post-translační modifikace, polyglutamylace, proteiny asociované s mikrotubuly, spastin, vývoj nervové soustavy
|
|
|
Cytoskeletal orchestration of early mammalian development
Novotný, Jan ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Mašek, Jan (oponent)
Struktury cytoskeletu hrají klíčovou úlohu v raném savčím embryonálním vývoji. Mnohé práce ukázaly, že mikrotubuly, intermediární filamenta i aktinová mikrofilamenta jsou důležitým strukturním i funkčním prvkem všech hlavních událostí časné preimplantační ontogenese. Během procesu polarizace se mikroklky vyztužené svazky aktinových filament přesouvají k jednomu pólu blastomery. Další významné změny prodělávají složky cytoskeletu v období kompakce embrya. Buňky adherují k okolním, zplošťují se díky kontrakcím komplexů aktinu a myosinu nebo tvorbě mezibuněčných spojů. Blastomery také vytváří filopodia, výběžky plasmatické membrány obsahující aktinová filamenta. Tyto struktury jsou zmiňovány pro svou úlohu v přibližování povrchů blastomer během embryonální kompakce nebo možnou roli v mezibuněčné signalizaci. Prvním procesem specifikace v raném savčím vývoji je rozlišení mezi zevními buňkami moruly, které se stávají presumptivním trofektodermem a vnitřními buňkami, budoucí vnitřní buněčnou masou embrya. Proteiny i struktury cytoskeletu jsou asymetricky distribuovány mezi tyto dvě buněčné populace a pomáhají tak určit vývojový osud každé blastomery. Tato práce si klade za cíl shrnout úlohy cytoskeletu v polarizaci blastomer, kompakci embrya a specifikaci vnitřní a zevní buněčné populace v průběhu...
|
|
|
Role of tau phosphorylation in formation of tau envelopes
Karhanová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Štěpánek, Luděk (oponent)
Tau je nestrukturovaný protein asociovaný s mikrotubuly důležitý pro vývoj axonů a kritický regulátor funkcí mikrotubulů v axonech. Aktivita Tau je řízena fosforylací a její deregulace vedoucí k hyperfosforylaci a agregaci tau je spojena s četnými neurodegenerativními poruchami, souhrnně nazývanými tauopatie. Na mikrotubulech se molekuly tau segregují do dvou kineticky odlišných fází, které se skládají buď z nezávisle difundujících molekul, nebo interagujících molekul, které tvoří soudržné "obálky" kolem mikrotubulů. Tau obálky regulují působení jiných proteinů asociaovaných s mikrotubuly, jako je pohyb molekulárních motorů, a chrání mikrotubuly před degradací enzymy rozdělujícími mikrotubuly. Jak je však formace, dynamika a funkce tau obálek regulována, není známo. Zde ukazujeme, že fosforylace tau brání tvorbě a fungování ochranných tau obálek. Pomocí kombinace rekonstitučních experimentů a zobrazování živých buněk ukazujeme, že fosforylovaný tau se zabudovává do tau obálek a že zpomaluje růst těchto obálek. Důležité je, že demonstrujeme, že fosforylace tau také destabilizuje již existující obálky, což vede k jejich rozpadu. Naše výsledky ukazují, že fosforylace tau interferuje s tvorbou a udržováním ochranných tau obálek in vitro a in vivo, což vede k nestabilitě mikrotubulů. Protože...
|
|
|
Role cytoskeletu při pohybu a navádění růstového kužele
Olekšák, Adam ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Weissová, Romana (oponent)
Růstový kužel je dynamickou strukturou na konci rostoucích neuritů, sloužící k navigaci jejich pohybu díky sledování gradientu atraktivních a repulsivních molekul v okolí nervové buňky. Klíčovou roli v pohybu růstového kužele zastává cytoskelet. Mikrotubuly a mikrofilamenta působí na plazmatickou membránu i podklad, na kterém neuron roste a umožňují jeho pohyb a tím i růst neuritů. Mikrofilamenta, která jsou více dynamická, než mikrotubuly, se nacházejí především na periferii růstového kužele a svou polymerací a depolymerací zajišťují dynamickou tvorbu filopodií růstového kužele, pomocí kterých neuron může získávat informace o svém okolí. Neurity také vytváří adheze k podkladu, na kterém buňka roste. Adheze umožňují dopředný růst neuritů. Směr, načasování a rychlost růstu neuritů reguluje řada proteinů, které asociují s mikrofilamenty. Podél mikrofilament do periferie růstového kužele pronikají mikrotubuly za pomoci motorových proteinů a proteinů, které propojují F-aktin s mikrotubuly. Ty jsou nezbytné pro snížení dynamiky růstového kužele, jeho zatáčení, transport váčků a přeměnu růstového kužele v další úsek rostoucího neuritu. Také dynamika a pohyb mikrotubulů jsou regulovány na řadě úrovní. Předmětem této práce je představit, jak v růstovém kuželu mikrotubuly a mikrofilamenta působí, a jak je...
|
|
|
Hafnium Chloride, an Alternative Staining Reagent for Biological Electron Microscopy
BARANYI, Magdalena Victoria
This study focuses on the staining pattern of the non-radioactive heavy metal EM stain HfCl4, used during freeze substitution specimen preparation. HfCl4 was investigated as an alternative for the prominent uranyl acetate, since uranium based materials have been placed under heavy restrictions and bans worldwide. We have found a strong HfCl4 staining pattern of microtubules in myoepithelial cells of Ixodes ricinus salivary glands. Additionally, in several samples, HfCl4 was found to completely fill the cytoplasm of the myoepithelial cells. Nonetheless, artefact formation around granulated cells was also experienced.
|
|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Indukce a průběh programované buněčné smrti v nádorových buňkách po aplikaci taxanů
Kábelová, Adéla ; Jelínek, Michael (vedoucí práce) ; Gemperle, Jakub (oponent)
Taxany jsou třídou běžně užívaných protinádorových léčiv zvláště účinných u nádorových onemocnění prsu, vaječníku, prostaty či plic. Taxany se váží se na β-tubulinovou podjednotku mikrotubulů, čímž vedou k jejich stabilizaci a inhibici depolymerizace. Takovéto mikrotubuly nejsou schopny tvořit funkční mitotické vřeténko a dochází k zablokování buněčného cyklu v G2/M fázi a následné apoptóze. Některé buňky si však k taxanům vyvinuly různé mechanismy rezistence. Ty mohou souviset s cílovým místem pro vazbu taxanů, tj. mikrotubuly nebo mohou být výsledkem zvýšené exprese specifických přenašečů, které odčerpávají taxany ven z buňky. Další typy rezistence jsou spojeny s procesem programované buněčné smrti (PCD), konkrétně s proteiny, které se po aplikaci taxanů podílí na jejím zdárném průběhu. K těmto proteinům patří rodina Bcl-2, která reguluje iniciaci PCD udržováním integrity membrány mitochondrií a endoplasmatického retikula a jejichž aktivita může být taxany přímo či nepřímo ovlivňována. Výkonnou složkou PCD jsou kaspázy, kde zvláště důležitou se zdá být kaspáza-2 aktivovaná v důsledku taxany-indukovaného cytoskeletárního poškození. V některých případech mohou taxany vést k buněčné smrti nezávisle na kaspázách. Zvláštní úlohu má protein p53, který se do apoptózy indukované taxany zapojuje pouze při aplikaci...
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
host ::
RSS.